Catabolismo de furfurales y compuestos aromáticos en "Pseudomonas pseudoalcaligenes" CECT 5344. Aislamiento de nuevas cepas asimiladoras de cianuro y sus complejos metálicos

El trabajo que se presenta en esta memoria de Tesis Doctoral se ha realizado en el Grupo de Biotecnología de Microorganismos (BIOMIC) del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura.“Pseudomonas pseudoalcaligenes” CECT 5344, una bacteria cianotrofa capaz de metabolizar eficientemente cianuro en su forma libre, resulta poco eficiente en la degradación de complejos metálicos. Debido a ello, se buscaron otras cepas bacterianas capaces de asimilar eficientemente estos complejos, centralizándose el estudio en “Achromobacter sp”. y “Microbacterium kitamiense”. El conjunto de ellas permitió una mayor detoxificación de los residuos cianurados procedentes de la industria joyera. Puesto que “P. pseudoalcaligenes” CECT 5344 únicamente podía asimilar cianuro como fuente de nitrógeno, se buscaron fuentes de carbono que permitieran una rápida asimilación de éste, siendo el octanoato y el DL-malato las más eficientes en la asimilación de cianuro. La secuenciación del genoma de “P. pseudoalcaligene”s CECT 5344 permitió identificar operones implicados en la asimilación de compuestos aromáticos, entre ellos los furfurales, compuestos inhibidores presentes en hidrolizados lignocelulósicos que posteriormente fermentan para dar bioetanol. La mutación en el gen edd permitió a la bacteria no asimilar glucosa, manteniendo intacta su capacidad metabólica en compuestos furánicos, resultando útil en la detoxificación de hidrolizados lignocelulósicos. El análisis transcriptómico de “P. pseudoalcaligenes” CECT 5344 cultivada en alcohol furfurílico permitieron ratificar la implicación del operón “hmf”, previamente descrito en “Cupriavidus basilensis” HMF14, en la asimilación de los compuestos furánicos, donde también está implicado el transportador de benzoato BenE1. Una mutación en este gen influyó negativamente en el crecimiento de la bacteria con compuestos furánicos. Además se observó la sobreexpresión del operón “liu”, cuya implicación en el metabolismo de éstos fue confirmada por mutagénesis en uno de sus genes.“Pseudomonas pseudoalcaligenes” CECT 5344 is a bacterium able to assimilate free cyanide, although it is not effective at degrading metal-cyanide complexes. Other bacteria able to assimilate these complexes efficiently have been isolated, and the study has been focused on “Achromobacter sp.” and “Microbacterium kitamiense” that, apart from using metal-cyanide complexes as nitrogen sources, they also use jewelry residues efficiently in mixed cultures together with the CECT 5344 strain. In as much as “P. Pseudoalcaligenes” CECT 5344 only assimilates cyanide as a nitrogen source, carbon sources that can quickly assimilate cyanide have been studied, with the octanoate and the DL-malate being the most efficient ones. The “P. Pseudoalcaligenes” CECT 5344 genome sequencing allowed the operons involved in the assimilation of aromatic complexes to be identified, amongst others furfurals: inhibitor compounds present in lignocellulosic hydrolysates that later ferment to obtain bioethanol. The edd gene mutation prevented the bacterium assimilating glucose, leaving the furfural catabolism intact. Consequently, it could be useful for lignocellulosic hydrolysates pretreatment. The transcriptional profile (RNA-seq) of “P. Pseudoalcaligenes” CECT 5344 growing with furfuryl alcohol allowed to identify the expression of a lot of genes. This includes the “hmf” operon which is homologous to the one described in “Cupriavidus basilensis“ HMF14 but that includes a new gene, “benE1”, in which a new mutant was generated. A mutation in this gene negatively affected the growth of the bacterium with furan compounds. Furthermore, another mutant was created in another overexpressed operon (“liu”), and its involvement in the metabolism of furoate was demonstrated.• Ministerio de Ciencia e Innovación: BIO2011-30026-C02-01 • Gobierno de Extremadura: PRI07A097 y Ayuda a Grupos-BioMic GR10165-CCV019 • Universidad de Extremadura: Beca de Investigación para licenciados dentro del programa de Captación y Formación de Recursos Humanos de Excelencia en Investigación, Desarrollo e Innovación. • Fondo Europeo de Desarrollo Regional: FEDER 2007-201